詳解CAR-NK前瞻性改造與CAR結構迭代，助力療效與安全性提升
發布時間：2023-03-19來源：點擊：2486
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在細胞療法朝著通用型、攻克實體瘤的大發展趨勢下，CAR-NK療法已然處于“風口”。近年來，CAR-NK療法的研發不斷升級加速，其CAR結構也經歷了多次迭代，基于不同的跨膜區和細胞內共刺激域的模塊化組合的優化結構設計，CAR-NK細胞的效力和持久性得到有效提升。
CAR-NK的CAR通常由三部分組成：胞外結構域、跨膜結構域以及胞內激活結構域。胞外結構域由信號肽、識別抗原的單鏈抗體片段（scFv）和鉸鏈區組成。這些結構的組合連同調控元件（例如啟動子）將決定CAR的功效。
四代CAR-NK
1
載體骨架和啟動子
載體骨架包含表達CAR所需的所有元件，包括啟動子、轉錄調控片段和聚腺苷酸化信號（polyA信號）。特定啟動子的選擇對轉基因的表達水平有直接影響，且可能受到scFv序列本身的影響。目前，尚難以確定CAR-NK細胞的最佳啟動子。但已有研究報道，在原代CAR-NK和CAR-NK細胞系中，病毒啟動子（如CMV、MPSV、MMLV、SFFV等）比組成型活動啟動子（如EF1α、PGK）更常用。
載體骨架和啟動子
載體骨架包含表達CAR所需的所有元件，包括啟動子、轉錄調控片段和聚腺苷酸化信號（polyA信號）。特定啟動子的選擇對轉基因的表達水平有直接影響，且可能受到scFv序列本身的影響。目前，尚難以確定CAR-NK細胞的最佳啟動子。但已有研究報道，在原代CAR-NK和CAR-NK細胞系中，病毒啟動子（如CMV、MPSV、MMLV、SFFV等）比組成型活動啟動子（如EF1α、PGK）更常用。
2
信號肽
CAR序列從一個短信號肽（SP）開始，信號肽中存在著巨大的異質性，這與不同水平的蛋白質分泌效率相關。目前CD8a-SP是原代NK細胞最常用的信號肽序列。盡管信號肽序列可能影響CAR的表達水平，但目前還沒有數據確定CAR-NK的最佳SP。
信號肽
CAR序列從一個短信號肽（SP）開始，信號肽中存在著巨大的異質性，這與不同水平的蛋白質分泌效率相關。目前CD8a-SP是原代NK細胞最常用的信號肽序列。盡管信號肽序列可能影響CAR的表達水平，但目前還沒有數據確定CAR-NK的最佳SP。
3
單鏈抗體片段（scFv）
scFv是CAR的腫瘤抗原結合域，不同的scFv可以結合相同蛋白質的不同表位，該結構域與CAR-NK細胞的特異性和功能有關。scFv的輕鏈和重鏈順序是人為確定的，對于CAR-NK的設計，大部分研究人員更偏向于VH-VL方向。有研究表明，即便是靶向相同抗原的scFv也會影響CAR表達的結果。
單鏈抗體片段（scFv）
scFv是CAR的腫瘤抗原結合域，不同的scFv可以結合相同蛋白質的不同表位，該結構域與CAR-NK細胞的特異性和功能有關。scFv的輕鏈和重鏈順序是人為確定的，對于CAR-NK的設計，大部分研究人員更偏向于VH-VL方向。有研究表明，即便是靶向相同抗原的scFv也會影響CAR表達的結果。
而單個免疫細胞可以配備多個scFv，這也擴大了CAR效應細胞識別抗原的能力。CAR-T細胞療法上的做法或許可以提供參照：一種是CAR可以選擇具有雙順反子原件的載體轉導，誘導兩種CAR的表達；另一種可以將兩個scFv融合到一個構建體中，從而產生串聯的scFv或“sing stalk”CAR。盡管無論是鼠源的還是人源的單鏈抗體，都有可能誘導宿主抗獨特型抗體的免疫反應，但從目前所做的臨床研究來看，尚未在CAR-NK試驗中發現與抗CAR免疫反應相關的重大副作用。
4
連接區
將重鏈與輕鏈進行連接的連接區可以穩定scFv的構象，部分決定了CAR識別靶表位的能力。對于CAR-NK而言，五肽GGGGS的多聚體應用最為廣泛，另一種常用的是Whit low“218”。
連接區
將重鏈與輕鏈進行連接的連接區可以穩定scFv的構象，部分決定了CAR識別靶表位的能力。對于CAR-NK而言，五肽GGGGS的多聚體應用最為廣泛，另一種常用的是Whit low“218”。
5
鉸鏈區
鉸鏈區負責將scFv連接到跨膜結構域，通常維持效應細胞中CAR表達和活性的穩定性。大部分CAR-NK采用的是CD8α或CD28胞外結構域的衍生物或基于IgG的鉸鏈區。而CD28相較于CD8α更能促進細胞分子二聚化，使得CAR的激活刺激更強，但也可能導致細胞因子釋放綜合征。基于IgG鉸鏈區的研究發現，其構建更具靈活性。目前，大部分原代NK細胞、CAR-NK細胞系使用的是CD8α鉸鏈區。
鉸鏈區
鉸鏈區負責將scFv連接到跨膜結構域，通常維持效應細胞中CAR表達和活性的穩定性。大部分CAR-NK采用的是CD8α或CD28胞外結構域的衍生物或基于IgG的鉸鏈區。而CD28相較于CD8α更能促進細胞分子二聚化，使得CAR的激活刺激更強，但也可能導致細胞因子釋放綜合征。基于IgG鉸鏈區的研究發現，其構建更具靈活性。目前，大部分原代NK細胞、CAR-NK細胞系使用的是CD8α鉸鏈區。
6
跨膜（TM）結構域
跨膜結構域將CAR的胞外域連接到胞內激活結構域，TM結構域的選擇影響了CAR結構在功能上活化的程度，其具體來源將決定CAR-NK的活性。最佳的TM結構域應該遵循T細胞或NK細胞上跨膜蛋白的天然取向（N-端到C-端的順序）。目前，CD8α和CD28衍生的TM結構域在原代CAR-NK細胞中最為常見，CD28是CAR-NK細胞系的首選。
跨膜（TM）結構域
跨膜結構域將CAR的胞外域連接到胞內激活結構域，TM結構域的選擇影響了CAR結構在功能上活化的程度，其具體來源將決定CAR-NK的活性。最佳的TM結構域應該遵循T細胞或NK細胞上跨膜蛋白的天然取向（N-端到C-端的順序）。目前，CD8α和CD28衍生的TM結構域在原代CAR-NK細胞中最為常見，CD28是CAR-NK細胞系的首選。
下一代CAR-NK
通過對上述各個結構域的優化，CAR-NK的CAR分子已經發展至第四代。第一代CAR分子包含一個合成的細胞外受體、一個跨膜域和一個細胞內信號域；第二代和第三代的CAR分子分別具有一個或多個細胞內共刺激結構域，共刺激分子通常來源于CD28家族、TNFR家族或SLAM相關受體家族。
有研究小組構建了具有CD28和4-1BB共刺激結構域的第三代CD33靶向CAR，并轉導了NK-92衍生的NK細胞。在1期研究中給3名R/R AML患者回輸，結果證明了該療法的安全性，但未獲得持久的療效，這一結果歸因于受輻射的NK-92細胞在體內的持久性有限。故而研發人員正探索更多樣化的CAR-NK療法，以解決其存在的局限性。
CAR-NK升級
前三代CAR結構的設計依賴于生理上發生的免疫細胞受體結構域，而第四代CAR又被稱為“武裝”CAR，則采用了一種截然不同的方法，加入了分子有效載荷，賦予CAR工程細胞額外的特性和功能，以解決免疫細胞療法存在的固有限制。此外，還有雙特異性/多特異性靶向CAR、邏輯門控CAR等多種經過優化升級的CAR類型。
7大工程化策略
這些“下一代”CAR-NK療法主要采用了7大工程化策略以提升持久性和抗腫瘤活性：
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異位表達趨化因子受體增強NK細胞的運輸和浸潤腫瘤的能力；
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敲除NK免疫功能負調節因子基因有助于克服功能衰竭；
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中和scFv可以阻斷已經與CRS/ICANS連接的細胞外GM-CSF；
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利用II-12/15/18細胞因子預處理誘導具有增強效力的憶樣NK細胞形成；
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敲除表面和細胞內分子防止自相殘殺或免疫抑制來調節NK細胞進行聯合治療；
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通過干預代謝途徑使得NK細胞能夠抵抗功能衰竭機制；
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抑制性受體的靶向基因消融可以保護CAR-NK細胞對抗免疫抑制性腫瘤微環境。
1
第四代CAR-NK
第四代CAR-NK可以包含多個理想的基因修飾，比如添加IL-15細胞因子基因，以保持CAR-NK在體內的持久性和抗腫瘤活性。CAR-NK賽道的頭部企業Nkarta曾稱其先導產品NKX101為“第四代”CAR-NK療法，NKX101的CAR經過工程改造，可表達與共刺激（OX2）和信號傳導（CD40ζ）結構域融合的嵌合NKG3D受體，這一受體能夠在目標腫瘤細胞中找到最多8種相關配體。此外，NKX101還表達白細胞介素-15作為自分泌生長因子，從而增加持久性。
第四代CAR-NK
第四代CAR-NK可以包含多個理想的基因修飾，比如添加IL-15細胞因子基因，以保持CAR-NK在體內的持久性和抗腫瘤活性。CAR-NK賽道的頭部企業Nkarta曾稱其先導產品NKX101為“第四代”CAR-NK療法，NKX101的CAR經過工程改造，可表達與共刺激（OX2）和信號傳導（CD40ζ）結構域融合的嵌合NKG3D受體，這一受體能夠在目標腫瘤細胞中找到最多8種相關配體。此外，NKX101還表達白細胞介素-15作為自分泌生長因子，從而增加持久性。
目前，第四代CAR-NK的研究較少，clinicaltrials.gov官網已顯示有多條第四代CAR-T療法的相關研究，CAR-T療法的進展較CAR-NK快，其CAR結構有著共通之處，在CAR的加載技術更加成熟后，想必第四代CAR-NK的研發將會更加順利。
2
雙特異性/多特異性CAR-NK
實體瘤具有高度異質性，即使是同一個病灶的腫瘤也可能表達不同的腫瘤相關新抗原，單一靶向的細胞療法往往面臨著挑戰，而雙特異性/多特異性靶向的方法有望解決異質性問題，猶如編織了一個更大的“網”，將更多腫瘤細胞一網打盡。
雙特異性/多特異性CAR-NK
實體瘤具有高度異質性，即使是同一個病灶的腫瘤也可能表達不同的腫瘤相關新抗原，單一靶向的細胞療法往往面臨著挑戰，而雙特異性/多特異性靶向的方法有望解決異質性問題，猶如編織了一個更大的“網”，將更多腫瘤細胞一網打盡。
目前，已有企業在探索雙特異性靶向CAR-NK。Cytovia Therapeutics曾宣布從CytoImmune獲得了其首創的用于膠質母細胞瘤和其他實體瘤的雙靶向CAR-NK的全球性產品權益。CytoImmune的創始人Michael A. Caligiuri博士及其團隊構建了一種能夠靶向表達EGFR野生型和/或突變EGFR vIII的的EGFR雙靶向CAR-NK，這一療法在動物模型中顯示出統計學上的顯著改善。
另外，Jeffrey Miller團隊曾在2021年報道了其研究成果，構建了一種多特異性B7-H3靶向的iPSC來源的CAR-NK，具有廣譜抗癌的潛力。不過這一概念較為前沿，真正落地還需要走很長一段路。
3
邏輯門控CAR-NK
邏輯門控CAR也稱為非門CAR，這種CAR將腫瘤中缺失的抗原作為激活免疫系統的靶標，能夠抑制T細胞與正常細胞上的抗原結合，從而有效避免“脫靶效應”。
邏輯門控CAR-NK
邏輯門控CAR也稱為非門CAR，這種CAR將腫瘤中缺失的抗原作為激活免疫系統的靶標，能夠抑制T細胞與正常細胞上的抗原結合，從而有效避免“脫靶效應”。
合成生物學大牛盧冠達創辦的Senti Bio曾在2021年舉辦的第36屆癌癥免疫治療學會年會上展示一種邏輯門控同種異體CAR-NK療法SENTI-401，將癌胚抗原（CEA）靶向激活CAR與抑制性CAR配對，后者負責識別在某些健康胃腸道和肺上皮細胞中獨特表達的安全抗原（SA），這一設計能夠靶向和殺死表達CEA的腫瘤細胞，同時避開表達CEA的健康上皮細胞。
在臨床前評估中，SENTI-401能夠有效殺死大腸癌細胞，并保護健康細胞，同時降低了毒性。2023年1月，Senti Bio宣布將優先推進邏輯門控細胞療法SENTI-401和SENTI-202。值得一提的是SENTI-202也是一種邏輯門控現成的CAR-NK細胞候選產品，旨在靶向和消除AML細胞，同時保留健康的骨髓，預計將在今年下半年提交IND申請。
2022年7月，德克薩斯大學MD安德森癌癥中心的研究人員在Nature Medicine上發表了一篇文章報道了一種。研究人員發現“胞啃”的生理過程通過引起腫瘤抗原丟失、NK細胞衰竭和自相殘殺，促成了腫瘤逃逸和CAR-NK細胞治療后反應不佳。在這一過程中，靶細胞表面蛋白會轉移到免疫細胞表面以引發自相殘殺的現象。
研究人員給CD19 CAR-NK細胞添加了一種旨在識別NK細胞特有的標志物的抑制性CAR，即使NK細胞表面攜帶腫瘤抗原，也可以通過第二個CAR向同類表達“不要殺我”的信號。在臨床前腫瘤模型中，邏輯門雙靶向CAR-NK能夠更好地聚集腫瘤細胞，減少了NK細胞耗竭及自相殘殺。
總結
盡管當下尚未有CAR-NK療法獲批上市，但其在治療實體瘤中的優勢使得這一療法備受期待。一位CAR-T研發人員曾表示：“人們對后來上市的CAR-T療法往往有更多的期待，所以我們在一代CAR-T療法的同時也會推進迭代產品的研究。”在其他賽道如TIL療法也不例外，TIL龍頭企業Iovance除了申報其核心管線LN-144外，已經布局了第三代TIL療法。同理，CAR-NK療法亦如是，想必隨著CAR的結構升級，CAR-NK療法的療效和安全性也將大大提升。
來源：醫麥客
